1 材料

　　1.1 蜂膠提取物取本地產(chǎn)蜂膠，冰凍粉碎后以95%乙醇浸泡72 h，過濾，濾液于40℃減壓揮干溶劑，二甲基亞砜（DMSO）溶解定容為2 mg/ml。

　　1.2 試劑及儀器RPMI1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細胞儀為美國BECTON DICKINSON公司產(chǎn)品；POD試劑盒購自華美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦顯微鏡（BIO-RAD公司產(chǎn)品）。

　　1.3 細胞株人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞株由白求恩國際和平醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科實驗室惠贈。

　　2 方法

　　2.1 蜂膠濃度分組實驗前用RPMI1640（Gibco公司）將蜂膠提取物稀釋成20，40，80，160 μg/ml，DMSO的濃度低于0.02%。

　　2.2 流式細胞儀檢測收集對照組和80 μg/ml蜂膠作用不同時間（24，48，72 h）的細胞，用PBS洗滌2遍，經(jīng)檸檬酸緩沖液固定1 h以上，上機前加1 800 μl胰酶消化液充分作用，加入1 500 μl碘化丙啶（PI）作用15 min以上，過濾，上機進行細胞凋亡分析和細胞周期分析。

　　2.3 原位末端標記法（TUNEL）定量檢測分別于各劑量藥物作用后24，48，72 h收集細胞，PBS洗2次，細胞涂片，室溫干燥。按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作，用普通光鏡計算凋亡率（AI）。計算方法：隨機選取5個高倍視野，分別計陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，代入下式：AI=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

　　2.4 Hep-2細胞內(nèi)Ca2+變化的激光共聚焦顯微鏡檢測對數(shù)生長期Hep-2細胞，用D-Hanks液洗滌2次，于37℃避光條件下Fluo-3/AM（10 μmol/L）荷載。40 min后用D-Hanks液洗滌細胞3次，洗去細胞外殘余染料，最后保留少許細胞外D-Hanks緩沖液，平衡10 min。經(jīng)不同濃度蜂膠作用不同時間，在激光共聚焦顯微鏡下掃描細胞內(nèi)熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm，以本底熒光強度為參照（0），檢測細胞內(nèi)Ca2+熒光強度。

　　2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料用±s表示，比較時采用t檢驗。α=0.050。

　　3 結(jié)果

　　3.1 流式細胞儀檢查結(jié)果80 μg/ml蜂膠對Hep-2細胞凋亡率的影響：24，48，72 h時Hep-2細胞抑制率分別為36.2%，44.5%，58.6%，時間越長細胞凋亡率越高（P<0.05）。24，48，72 h時G0/G1期細胞分別占67.2%，55.8%，59.4%；S期分別占19.1%，28.3%，33.5%；G2/M期分別占13.7%，15.9%，7.1%。

　　3.2 TUNEL標記各組細胞凋亡率明顯升高，與同時間對照組比較差異有顯著性，且呈現(xiàn)一定的時間、劑量依賴性。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，各時間組、各劑量組相關系數(shù)r經(jīng)檢驗，P<0.013.3 Hep-2細胞內(nèi)Ca2+的變化結(jié)果見表2。隨藥物濃度的增加，不同濃度組之間的細胞內(nèi)Ca2+熒光強度亦增高。P<0.05。

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